DNA-Bildzytometrie zum Ausschluss eines Progresses bei Mikrokarzinomen der Prostata

Hintergrund:Die Entscheidung zu einer Aktiven Überwachungsstrategie bei Vorliegen eines sog. klinisch insignifikanten Mikrokarzinoms der Prostata beruht derzeit neben der geringen Ausdehnung des Tumorherdes und dem PSA-Wert im Blut entscheidend auf der subjektiven histopathologischen Malignitätsgradierung an gefärbten Schnitten von Stanzbiopsien nach Gleason (1973) (Interdisziplinäre S3-Leitlinie Prostatakarzinom, 2009). Diese Gradierung ist erwiesenermaßen schlecht reproduzierbar (Burchardt et al., 2008) und nicht hinreichend prognostisch valide (Böcking, 2011).

Die Entscheidung zu einer Aktiven Überwachungsstrategie soll durch einen objektiven, reproduzierbaren, prognostisch validen Parameter abgesichert werden mit dem ein Progress von Mikrokarzinomen der Prostata genauer vorhergesagt werden kann als alleine mit dem Gleason-Wert.

Der Nachweis einer DNA-Diploidie bei einem Gleason-Wert 6 und ggf. 7a könnte sich als zusätzliches Einschlusskriterium für eine Aktive Überwachungsstrategie bei Patienten mit Mikrokarzinomen der Prostata empfehlen (siehe „Anleitung Prostatakarzinom“ der Deutschen Gesellschaft für Pathologie und des Bundesverbandes Deutscher Pathologen, März 2011).

Die DNA-Bildzytometrie ist eine anerkannte, im Einheitlichen Bewertungsmaßstab (EBM Nr. 19330) enthaltene, in Deutschland verfügbare Diagnosemethode.

Hypothesen

Diese Studie geht von der Hypothese aus, dass die gesuchte, objektive, reproduzierbare, dem Gleasonwert überlegene prognostische Variable die sog. DNA-Ploidie ist.

  1. Die DNA-Bildzytometrie an Stanzbiopsien der Prostata (Peridiploidie mit niedriger Proliferationsfraktion, Tribukait, 2006) kann das Auftreten eines Progresses von unbehandelten Mikrokarzinomen unter Aktiver Überwachung signifikant besser vorhersagen als der Gleason-Wert (6 und 7a) alleine. Die negativen Prädiktionswerte für die Vorhersage einer Nicht-Progression sollten sich zwischen beiden Verfahren demnach signifikant unterscheiden.
  2. Das jährliche Progressionsrisiko für DNA-diploide Mikrokarzinome ist ≤1 %, in 5 Jahren also ≤5 %.
  3. Die interindividuelle Reproduzierbarkeit der objektiven, prognostischen DNA-Bildzytometrie ist signifikant höher als die subjektive Gleason Gradierung.
  4. Eine Verkürzung der PSA-Verdoppelungszeit auf unter 3 Jahre bei primär peridiploiden Mikrokarzinomen des Typs A geht mit einer Änderung des DNA-Ploidie-Musters Richtung der Typen B oder C einher.

Studiendesign

An den Stanzbiopsien von 287 Patienten mit Mikrokarzinomen der Prostata die im Rahmen der HAROW-Studie eine Aktive Überwachungsstrategie verfolgen, soll eine DNA-Bildzytometrie nach gezielter enzymatischer Zellvereinzelung durchgeführt werden (http://www.harow.de). An allen Rebiopsien, welche Karzinomherde aufweisen, soll ebenfalls eine DNA-Bildzytometrie erfolgen, um ggf. eine Tumorprogression DNA-zytometrisch nachzuweisen.

Die DNA-Histogramme werden klassifiziert in die vier Gruppen: A, B, C und D gemäß dem beigefügten Schema (Tribukait 1993). Ferner soll eine Modifikation dieser Klassifikation in sechs Gruppen A, AB, B, BC, C und D (Haroske et al., 2001; Engelhardt, 2011, Tils, 2011) erfolgen. Die Erweiterung der bisherigen vier (Tribukait, 1993) auf sechs prognostische Gruppen ergab sich durch die Erkenntnis, dass die Hinzunahme der Proliferationsfraktion (> 5%) bei den Patienten mit diploiden Karzinomen eine weitere prognostische Differenzierung erlaubt (Tribukait, 2006). Als prognostisch besonders günstig, mit dem geringsten Risiko für einen Progress und daher am ehesten für eine Aktive Überwachung geeignet, sind demnach Patienten mit Mikrokarzinomen des Typs A (peridiploid mit Proliferationsfraktion <5%). Ob ggf. auch Patienten mit Mikro-Prostatakarzinomen der Typen AB oder B ein derart niedriges Progressionsrisiko aufweisen, soll im Rahmen dieser Studie ebenfalls geprüft werden.

Die DNA-zytometrischen Untersuchungen werden am Schwerpunkt Cytopathologie der Universität Düsseldorf unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. Stefan Biesterfeld durchgeführt. An der HAROW Studie teilnehmenden Urologen werden mit der Bitte angeschrieben, Namen und Adressen der Pathologen mitzuteilen, welche die Stanzbiopsien geprüft hatten. Auf der Grundlage der Patienteneinwilligungen zur Durchführung weiterer Labor-Untersuchungen an ihren Biopsien, werden die Pathologen um leihweise Übersendung der tumorhaltigen Paraffin-Blöcke samt zugehörigen Schnittpräparaten und Kopien der histologischen Begutachtungen gebeten. Nach Durchführung der DNA-Zytometrie erhalten die Pathologen die Paraffinblöcke samt histologischen Schnitten zusammen mit einer Kopie des DNA-zytometrischen Befundes zurück.

Als früher Indikator für einen Progress der Mikrokarzinome, bzw. Referenz-Standard dieser Studie, ist ein Anstieg des PSA-Wertes im Serum mit einer Verdoppelungszeit von unter drei Jahren vorgesehen, oder ein Anstieg des Gleason-Wertes auf >6. Der Tumor wird in den ersten beiden Jahren durch PSA-Bestimmungen und digitale rektale Untersuchung alle drei Monate kontrolliert. Bleibt er stabil, wird sechsmonatlich untersucht. Rebiopsien werden alle 12- bis 18 Monate vorgenommen (entsprechend der Interdisziplinären Leitlinie der Qualität S3 zur Früherkennung, Diagnose und Therapie der verschiedenen Stadien des Prostatakarzinoms, 2009).

Nach Markierung der karzinomhaltigen Anteile auf den Schnittpräparaten und zugehörigen Paraffin-Blöckchen mittels Filzschreiber werden je drei 70 µm dicke Schnitte angefertigt und die tumorhaltigen Anteile einer enzymatischen Zellvereinzelung unterzogen (der Rest wird verworfen). Es folgt eine spezifische Färbung der Erbsubstanz DNA mit Pararosanilin nach R. Feulgen (1923). Die Messung des DNA-Gehaltes von mindestens 300 Tumor-Zellkernen und > 30 Kernen von Fibroblasten zur internen Kalibrierung erfolgt an dem als in-vitro-diagnostisches Gerät CE-zertifizierten MotiCyte-DNA (siehe Anlage). Die Vorklassifikation der Zellkerne in Karzinomzellen und Fibroblasten erfolgt automatisch mit einem von Prof. Dr. Alfred Böcking an 47.000 Objekten aus Prostatakarzinom-Zellvereinzelungs-Präparaten trainierten digitalen bildanalytischen Klassifikator (k-NN), welcher < 1% der Tumorzellkerne übersieht (Kooperation mit dem Lehrstuhl für Bildverarbeitung der RWTH Aachen, Prof. Dr. T. Aach, D. Friedrich). Das Ergebnis der automatischen Klassifikation wird von der Pathologin (Frau Dr. N. Pomjanski, Schwerpunkt Cytopathologie) an einer sog. Bildgalerie überprüft und validiert. Die objektive Klassifikation der resultierenden DNA-Histogramme erfolgt automatisch gemäß dem vorgegebenen Algorithmus (Engelhardt, 2011; Tils 2011) nach einem von Dipl. Math. David Friedrich entwickelten Software-Programm des MotiCyte-DNA. Zur Ermittlung der interindividuellen Reproduzierbarkeit der DNA-Gradierung wird diese nachträglich verblindet, sowohl subjektiv und unabhängig durch Prof. Böcking wiederholt, als auch von Prof. Biesterfeld ein zweites Mal einer automatischen digitalen Klassifikation unterzogen.

Die ermittelten DNA-Gradierungen werden in Unkenntnis des klinischen Verlaufes an die Zentrale der HAROW-Studie übermittelt. Nach Ablauf einer Mindestnachbeobachtungszeit von fünf Jahren pro Patient werden die Ergebnisse der klinischen Nachbeobachtung bezüglich eines Progresses mit den Ergebnissen DNA-Bildzytometrie zusammengeführt. Die statistische Auswertung mit Ermittlung der positiven und negativen Prädiktionswerte erfolgt samt Vergleich der Signifikanzen im Rahmen der HAROW-Studie. Eine Auswertung erfolgt auch für die Patienten, deren fünfjährige Beobachtungszeit noch nicht abgelaufen ist. Die interindividuellen Reproduzierbarkeiten der Gleason- bzw. DNA-Malignitäts-Gradierung werden am Schwerpunkt Cytopathologie der Universität Düsseldorf ermittelt.

Patienten-relevante Endpunkte

Das Risiko einer therapeutischen Fehlentscheidung soll gesenkt werden durch Einbeziehung einer „diploiden DNA-Verteilung mit niedriger Proliferations-Fraktion“ in die Kriterien für eine Aktive Überwachungsstrategie bei klinisch insignifikanten Mikrokarzinomen der Prostata zusätzlich zum Gleason-Wert. Damit könnte Männern eine verbesserte Entscheidungsgrundlage für eine Aktive Überwachung verfügbar werden mit der Nebenwirkungen operativer oder radiologischer Therapien vermieden und Lebensqualität erhalten würde. Andererseits würde der Nachweis einer DNA-Aneuploidie rechtzeitig erkannt und eine andere S3-Leitlinien basierte Therapie würde zu wählen sein.

Publikationen

Die Ergebnisse der Studie werden in peer-reviewed, englischsprachigen Fachzeitschriften für Urologie und/oder Pathologie publiziert.

Federführung

Prof. Dr. med. Stefan Biesterfeld, Leiter des Schwerpunktes Cytopathologie, Heinrich-Heine Universität Düsseldorf, für das Fach Pathologie

Prof. Dr. med. Lothar Weißbach, Wissenschaftlicher Vorstand der Stiftung Männergesundheit, Berlin, für das Fach Urologie

Laufzeit: Ein Jahr